Питательные среды для выращивания клеток

После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т.е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.

Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотнощелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования.

Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатносолевой буфер Дульбекко и Фогта используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах эти величины близки. Осмоляльность раствора (осмоль/кг) = S mi*xi, где mi концентрация i-го растворенного вещества (моль/кг), xi количество частиц, на которые диссоциировала его молекула. Например, для раствора Эрла расчетная величина осмоляльности равна 310.6 мосмоль/кг, реальная 283. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Например, для клонального роста диплоидных фибробластов человека WI38 оптимальны рН=7.30 + 0.15 и осмоляльность 285 + 40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона цыпленка 7.12 + 0.18 и 300 + 20 соответственно. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: HCO3 = CO2 + OH, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры ведутся вне СО2инкубатора, где рН поддерживать труднее, необходимы альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES легко растворим в воде, не связывает двухвалентные катионы, не цитотоксичен до концентрации 0.05 Моль. Применяется в концентрациях 0.01 0.03 М.

Стандартные среды для ведения культур животных клеток. Среды Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ. Она содержит минеральные вещества, аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа раствор Эрла.

Среда Дульбекко DME или DMEM (двойная модификация среды Игла). Используется при культивировании клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. Является основой для бессывороточных сред. Содержит двойную концентрацию аминокислот, глицин, серин, пируват, железо. При использовании этой среды необходим инкубатор с 10% концентрацией СО2.

Среда Искова IMDM — модификация среда Дульбекко. Добавлены незаменимые аминокислоты, биотин, витамин В12, селенит натрия. В среду введен HEPES и уменьшены концентрации NaCl и NaHCO3. Среда бессывороточная, обычно используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.

Среда МакКоя 5А и серия сред RPMI. Среда МакКоя 5А разработана в 1958 году для поддержания клонального роста клеток карциносаркомы Уолкера 256 в присутствии сыворотки, а затем уже других первичных культур и различных клеточных линий. Обычно производится в модификации Ивката и Грейса (RPMI) и предназначена для культивирования лейкоцитов в присутствии сыворотки, часто применяется и для культивирования гибридом. Концентрация СО2 в атмосфере при культивировании 5%.

Среда 199 разработана в 1950 году для культивирования фрагментов сердца из эмбриона цыпленка. Для среды характерны широкий спектр питательных веществ и невысокая их концентрация. Используется без добавок, как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток. Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5 — 20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.

Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста.

Большинство ростовых факторов присутствуют в сыворотке в концентрации нескольких нанаграммов на миллилитр и ниже. Некоторые из этих факторов специфичны для клеток на определенной стадии дифференцировки, действие других не ограничено какимлибо одним типом клеток. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами. Например, фибробласты размножаются в ответ на фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, фактор роста, синтезируемый тромбоцитами и соматомедины. Все эти вещества являются митогенами (стимулируют митоз). Другим важным фактором роста практически для всех типов клеток является гормон инсулин. Из других гормонов наиболее часто применяются глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щитовидной железы (трииодтиронин). Гормоны стимулируют или подавляют рост в зависимости от типа клеток и их плотности. Глюкокортикоиды, например, влияют на пролиферацию клеток, изменяя их чувствительность к факторам роста.

Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. Транспорт железа обеспечивает трансферрин, а поверхность большинства культивируемых клеток содержит рецепторы для этого белка. К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся коллаген и фибронектин, более специализированы хондронектин (адгезия хондроцитов) и ламинин (адгезия эпителиальных клеток).

В последние годы разработаны бессывороточные среды для размножения клеток. Чаще всего эти среды узко специализированы, т.е. предназначены для определенного типа клеток. К базовой среде добавляется инсулин, трансферрин, гидрокортизон или его аналог дексаметазон и т.д. Бессывороточные среды имеют определенные преимущества: улучшение воспроизводимости результатов опыта вследствие большей стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмой; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; снижение влияния дополнительных белков на результаты биологических исследований; отсутствие цитотоксичности сыворотки. Культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает и ряд недостатков: для большинства тканей сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани, поэтому, например, сыворотка вызывает рост фибробластов, но тормозит рост эпидермальных кератиноцитов; сыворотка может быть цитотоксичной, так как содержит полиаминоксидазу, действующую на полиамины (спермин, спермидин), являющиеся продуктами секреции быстро пролиферирующих клеток (эмбриональная сыворотка содержит относительно много такого фермента); значительная вариабельность состава сывороток разных партий; сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических ростовых факторов, что вызывает необходимость добавления их к культурам клеток.

Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и распластаться на нем. В связи с этим встает вопрос о подходящем материале. В качестве субстрата в настоящее время используют несколько материалов. Стекло лучше всего пирекс (алюмоборосиликатное стекло), так как натрийсиликатное стекло может подщелачивать среду и его необходимо кипятить в слабой кислоте перед употреблением. С каждым использованием пригодность такого стекла падает. Пластик — чаще всего используют полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон и другие. Металлы — подходит как нержавеющая сталь, так и титан, так как эти вещества химически инертны и обладают высоким отрицательным поверхностным зарядом. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Этого можно достичь химической обработкой окисляющими агентами или физическими воздействиями (высоковольтным разрядом, ультрафиолетовым светом, бомбардировкой высокоэнергетическими электронами). Фирмы, производящие пластиковую посуду, используют эти методы. Некоторые исследователи, несмотря на это, предпочитают даже новую посуду перед посадкой клеток обрабатывать смесью концентрированной серной кислоты и бихромата калия (хромовая смесь), после чего следует тщательная промывка. Иногда поверхность сосуда покрывают веществом, облегчающим прикрепление клеток. Наиболее часто для этого используют коллаген и полиаминокислоты.

Существует 2 основных системы культивирования клеток.

1. Непроточные культуры — тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:

прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);

постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);

перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).

Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.

Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток:монослойные культуры и суспензионные культуры.

Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:

1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.

2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.

3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.

4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.

5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

Недостатками монослойных культур являются:

требования большого пространства;

возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;

сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.

Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления (рис. 1):

1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).

2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.

3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.

Использование культуры клеток человека

Практически любые клетки человека могут быть введены в культуру и служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях. Одно из важнейших преимуществ клеток в культуре — возможность прижизненного наблюдения за ними с помощью микроскопа. Немаловажно и то, что культуры клеток к ряде случаем могут быть равноценной заменой клинических экспериментов, для которых потребовалось бы участие добровольцев. Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стёклах.

Благодаря культивированию клеток возможности исследования и диагностики расширяются почти беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток, их реакции на различные агенты, в том числе и на лекарственные воздействия. Поскольку клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, то при работе с ними радиоактивные предшественники, яды, гормоны и другие агенты могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода. Исчезает опасность того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило, легко установить время контакта исследуемого вещества с клетками, изменение его концентрации в течение данного периода времени. Это обеспечивает получение реальных значений скорости включения или метаболизма исследуемых соединений.

Клеточные линии применяют для тестирования и изучения механизма действия различных веществ, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, детергентов, косметических средств, инсектицидов, консервантов. Результаты, полученные на клеточных культурах, нельзя экстраполировать на целый организм, но если изучаемое вещество оказывает повреждающее действие в нескольких линиях культивируемых клеток, то следует ожидать от неблагоприятного эффекта и на организм человека.

Кроме того, если в ряду поколений воспроизводится дефект, свойственный клеткам in vivo, значит это дефект наследственный. Благодаря возможностям генной инженерии изменение генотипа клеток стало реальностью. Мы можем выделить из организма мутантые клетки, заменить in vitro дефектные гены, получить линию здоровых генно-модифицированных клеток и ввести их опять в организм.

Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Широкое использование фибробластов для изучения патогенеза и диагностики наследственных болезней обусловлено не только легкостью их культивирования, но и тем, что соединительная ткань, главным клеточным элементом которой являются фибробласты, составляет значительную часть массы тела. Кроме того, фибробласты составляют строму многих органов, являются важными участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения, необходимого для дифференцировки и функционирования специализированных клеток. В фибробластах имеется фермент моноаминоксидаза, изменения активности которого характерны для некоторых нервных и психических заболеваний. Фибробласты содержат рецепторы к глюкокортикоидным гормонам, инсулину, некоторым нейромедиаторам.

Гринбергом в 1978 году была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo.

Во-первых, фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуальногенотипические свойства организма-донора.

Во-вторых, не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма.

В-третьих, изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.

Все вышеперечисленное также способствует использованию фибробластов для изучения клеточных, биохимических, молекулярных аспектов патогенеза ряда болезней, в том числе и связанных с наследственными дефектами нервной системы.

biofile.ru

Способы выращивания клеток животных

Глубинное выращивание клеток в монослое. Направлено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы. При этом клетки животных размножаются, растут и развиваются в прикрепленном состоянии до тех пор, пока не сольются в монослой. Рост клеток в виде монослоя зависит от белков – фибронектинов (от лат. fibro – нить, nectere – связывать или соединять). Фибронектин – гликопротеин, обеспечивает межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке, направляет их перемещение.

Прикрепление клеток зависит от следующих свойств субстрата: гидрофильность – адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей; протяженность – поверхность субстрата должна быть больше нормальной длины клетки; горизонтальность – растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата. Например, если принять прикрепление клеток к агар-агару за единицу, то к полиэтилену они прикрепляются лучше в 8 раз, к резине – в 12 раз, к стеклу – в 16 раз, а к стали – в 20 раз.

В монослое выращивают клетки соединительной ткани (фибробласты), клетки почек кроликов, обезьян, собак, 10-14-дневных куриных эмбрионов. Выращивание проводят в строго асептических условиях при покачивании для омывания большей площади культуральной среды. Клетки попеременно погружают в жидкую и газообразную фазу, при этом с избытком обеспечивается потребность в кислороде.

Во время культивирования клеток учитываются следующие параметры: константные – качество материала, форма и объем культиватора; вариабельные – скорость покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО2 в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация основных источников питания.

Глубинное выращивание клеток в суспензированных культурах. При использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде, площадь выращиваемых клеток увеличивается. Клетки закрепляются на их поверхности, а затем разрастаются в виде монослоя. В таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры клеток животных.

Применяют следующие микроносители: положительно заряженные ДЕАЕ-сефадексы (комбинация высокомолекулярного полимера декстрана с ионообменными смолами); сефадексы с коллагеновым покрытием (высокомолекулярный полимер декстрана); отрицательно заряженный полистирол; полые стеклянные сферы; микроносители из пористого шлачного стекла и др. После выращивания клетки отделяют от микроносителей центрифугированием; фильтрованием; обработкой трипсином с последующим промыванием и сепарированием.

Данный метод применяется для получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура).

Дата добавления: 2016-02-27 ; просмотров: 618 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Питательные среды для выращивания клеток животных

Функции сред для выращивания клеток: поддержание необходимых для роста физико-химических условий; обеспечение клеток питательными веществами для синтеза клеточной биомассы и продуктов.

Среда культивирования может создавать следующие условия: для клонального роста, т.е. для роста одиночной клетки; массового выращивания клеток; образования целевого продукта; поддержания обмена веществ у неделящихся клеток.

Первоначально для культивирования клеток создавались комплексные среды на основе плазмы крови и других биологических жидкостей. Наиболее рациональным при выборе состава сред является уменьшение числа компонентов до минимума, необходимого для роста, т.е. создание так называемых минимальных сред.

Термин «питательное вещество» подразумевает вещество, которое поступает в клетки и используется как метаболический субстрат или кофактор. Известны незаменимые питательные вещества – это аминокислоты, витамины, растворенные газы, неорганические ионы, источники энергии.

Основной состав питательных сред:

Источники энергии – глюкоза, глютамин, фруктоза, галактоза, уридин и цитидин.

Аминокислоты. Для культивирования клеток незаменимыми считаются 13 аминокислот (аргинин, цистин, глутамин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, тирозин, валин). Потребность в них снижается, если в среде содержится достаточно заменимых аминокислот (аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, пролин, глицин, серин). Важное значение имеет баланс между аминокислотами.

Витамины. Для многих культивируемых клеток необходимы водорастворимые витамины (биотин, фолиевая кислота, никотинамид, пантотеновая кислота, пиридоксин, рибофлавин и тиамин). Например, аскорбиновая кислота увеличивает урожай интерферона при его получении из культур клеток человека на микроносителе. Информация о влиянии жирорастворимых витаминов (А, D, Е, К и др.) на культивируемые клетки весьма ограничена.

Неорганические ионы. Клеткам животных для роста требуется натрий, калий, кальций, магний, фосфат, бикарбонат, хлорид. Они необходимы для поддержания осмотического давления; создания потенциалов у мембран; регулирования рН (за счет буферности); способствуют прикреплению клеток к различным поверхностям; действуют как кофакторы для энзиматических реакций; от соотношения различных ионов, особенно ионов натрия и калия, зависит урожай клеток и скорость их роста.

Следовые элементы. Считают, что для животных клеток незаменимыми или полезными являются 15 элементов: Со, Сu, I, Fe, Mn, Mo, Zn, Se, Cr, Ni, V, As, Si, Sn. Следовые элементы переходят в среды из химических соединений или из стекла (колбы, бутыли).

Липиды. Источник липидов – сыворотка. Она содержит белки, транспортирующие липиды: альбумин – переносит свободные жирные кислоты, и липопротеины – транспортируют фосфолипиды, триглицериды и холестерол.

рН и буферные растворы. Оптимальное значение рН для максимального роста клеток – 6,9-7,8. Для оптимизации рН применяют неорганические буферы (например, карбонатный буфер – СО /НСО — ) или органические буферы (?-глицерофосфат).

Газы. Кислород – незаменимый элемент для роста клеток млекопитающих. Потребность в нем обеспечивают путем обдувания поверхности среды воздухом или смесью, содержащей 95% воздуха и 5% СО2. Двуокись углерода – растворяется в воде, служит источником бикарбоната. Для некоторых клеток оптимальна газовая смесь, содержащая 0,5-2,0% СО2.

Антибиотики. Наиболее часто применяют антибактериальные агенты – пенициллин, стрептомицин, гентамицин; противогрибковые агенты – амфотерицин, нистатин. Постоянное применение антибиотиков не желательно из-за выработки резистентных микроорганизмов; отрицательного влияния на рост и функции клеток; снижения урожайности, скорости роста и сохраняемости клеток.

Неопределенные добавки – сыворотки эмбриона теленка, новорожденных телят и лошадей. Функции сыворотки: является носителем для лабильных или нерастворимых в воде питательных веществ; связывает или нейтрализует токсины; содержит ингибиторы протеазы, которая инактивирует трипсин; способствует прикреплению клеток к субстрату; является источником незаменимых низкомолекулярных питательных веществ, гормонов и пептидных факторов роста; обладает защитным эффектом (например, при перемешивании). При использовании сыворотки возникают следующие проблемы: вариабельность состава; высокая стоимость и периодическая дефицитность; источник контаминации микоплазмами, бактериофагами, вирусами и др.; источник токсинов; модифицирование поверхности клеток вследствие адсорбции или внедрения сывороточных белков; невозможность точно определить питательность среды; осложнения при очистке продуктов; чрезмерный рост фибробластов в первичных культурах других типов клеток.

В бессывороточные питательные среды вводят и другие неопределенные добавки (пептоны, эмульсии яичного желтка, гидролизат лактальбумина, триптозный фосфат и молоко).

При выборе среды следует учитывать:

· Любые данные о предшествующем использовании; наиболее надежно применение той среды, которая ранее показала хорошие результаты для данного типа клеток.

· Тип клеток. Трансформированные и отселекционированные клеточные линии обычно относительно хорошо растут в более простой среде или требуют меньше сыворотки, чем нетрансформированные или первичные клеточные линии.

· Обеспеченность материалом. Специализированные предприятия обеспечивают широкий выбор традиционных сред и необходимый набор бессывороточных смесей (например, среда Искова). Должны быть также доступными ростовые факторы и добавки к бессывороточным средам.

· Стоимость. Дороговизна сыворотки должна балансировать высокой стоимостью добавок к бессывороточным средам.

· Точность химического состава. Например, для ряда исследований предпочтительны бессывороточные среды.

Вопросы для самоконтроля

1) История применения культур клеток животных.

2) Разъясните понятия «рост клеток», «специализация клеток» и «трансформация клеток».

3) Перечислите этапы культивирования клеток животных.

4) Методы сепарации клеток животных.

5) Какие ферменты используют для диссоциации тканей?

6) Какие приемы используют для сбора урожая клеток и подсчета их общего числа?

7) Методы синхронизации роста клеток.

8) Иммобилизация и микрокапсулирование клеток: значение, приемы.

9) Консервирование клеток животных.

10) Технология восстановления жизненных функций клеток после консервирования.

11) Глубинное выращивание клеток в монослое.

12) Глубинное выращивание клтоек в суспензионных культурах.

13) Какие факторы следует учитывать при выборе питательной среды для культивирования клеток животных?

14) Перечислите основные компоненты питательных сред для культивированич клеток животных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Блинов, В.А. Общая биотехнология: Курс лекций. В 2-х частях. Ч. 2. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский СГАУ», 2004. – 144 с. – ISBN 5-7011-0436-2

2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак.– М: Мир, 2002. – 589 с.

3. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – ISBN 5-02-026027-4

4. Клунова, С.М. Биотехнология: учебник / С.М. Клунова, Т.А. Егорова, Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2010. – 256 с. – ISBN 978-5-7695-6697-4

5. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха В.С. и др. – М.: Высшая школа, 2003. – 427 с. – ISBN: 5-06-004264-2

6. Тарантул, В.З. Толковый биотехнологический словарь русско-английский: справочное издание [Электронный ресурс] / В.З. Тарантул. – М.: Языки славянских культур, 2009. – 936 с. – ISBN: 978-5-95-51-0342-6 – Доступ с сайта научной библиотеки СГАУ – ЭБС IPRbooks

7. Цыганский, Р.А. Физиология и патология животной клетки: учебное пособие / Р.А. Цыганский. – СПб.: Лань, 2009. – 336 с. – ISBN 978-5-8114-0870-2

Дополнительная

1. Биотехнология: учебное пособие для вузов, в 8 кн., под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М., 1987.

2. Журнал «Биотехнология» (аннотации статей) (ссылка доступа – http://www.genetika.ru/journal)

3. Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» (ссылка доступа – http://cbio.ru)

4. Оn-line-журнал «Биотехнология. Теория и практика» (ссылка доступа – http://www.biotechlink.org)

Лекция 9

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Этапы технологии трансплантации эмбрионов

Биотехнология имеет особое значение в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. От одной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год. Однако в ее яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов). Они представляют огромный генетический резерв. Ускорить воспроизводство скота можно при переходе к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. В последнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов. Использование этого метода в сочетании с длительным хранением семени в замороженном состоянии позволяет получить десятки тысяч потомков от одного производителя в год и освободить генетически выдающихся самок от необходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Суть метода состоит в том, что самок стимулируют с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам.

Технология трансплантации эмбрионов включает следующие этапы:

Отбор доноров.В качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальных племенных быков. На первом этапе племенная ценность донора оценивается по главным признакам молочного скота – по уровню молочной продуктивности и жирности молока. На втором этапе число признаков в зависимости от цели селекции расширяется (форма вымени и сосков, свойства молокоотдачи, резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества). Предпочтение отдают коровам, которые сохранили в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность. От таких коров можно регулярно получать эмбрионы через каждые два месяца. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).

Вызывание суперовуляции. В группу доноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введение гормонов. Для стимуляции множественной овуляции используют: а) гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (СЖК) в сочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами. Вводят однократно. Этот способ позволяет вызывать суперовуляцию примерно у 70 % коров; б) фолликулостимулирующий гормон ФСГ или его комбинация с лютеинизирующим гормоном ЛГ в соотношении 5:1. Вводят многократно.

Оптимальный результат суперовуляции – выход из яичника в воронку яйцепровода 10 — 20 яйцеклеток. Эмбрионы можно получить менее чем от половины первоначально отобранных потенциальных коров-доноров. Хорошими донорами считают коров, которые после многократных суперовуляций имеют хорошую реакцию яичника и производят большое число пригодных для пересадки эмбрионов за одно вымывание.

Кормление доноров должно быть таким, чтобы они находились в хорошем физиологическом состоянии. Рацион коровы-донора должен быть сбалансированным по основным питательным веществам, и особенно по аминокислотам и микроэлементам.

Искусственное осеменение коров-доноров.Для этого используют сперму только выдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Коров осеменяют дважды: первый раз при начале появления половой охоты и второй – через 12 — 24 часа. Со дня осеменения начинается отсчет развития эмбрионов in vitro.

Извлечение эмбрионов. Возможно три способа:

· Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора – самый простой и надежный способ. Этот способ практиковался только на первых этапах освоения метода трансплантации. В настоящее время он не используется из-за потери генетически ценной коровы-донора.

· Хирургический способ – эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения (разрез верхнего свода влагалища, лапаротомия по белой линии живота и лапаротомия в области голодной ямки). Этот способ трудоемкий, дорогостоящий, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время применяется редко, главным образом в научных целях.

· Нехирургический способ. Преимущество – простота манипуляций. Для этого не требуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственных условиях. При правильном применении этого способа воспроизводительная способность доноров не нарушается. Это позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров для получения от них большого числа потомков. Эмбрионы извлекают под местной анестезией путем вымывания (5 — 8 раз). Длительность манипуляции – 20 — 50 минут. После вымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотика. В среднем из вымытых яйцеклеток до 25 % оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными.

Кратковременное культивирование и хранение эмбрионов. Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися на предимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введения в рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужно создать оптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических качеств. Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможность транспортировать их в другие хозяйства.

Эмбрионы КРС можно сохранить путем пересадки их в яйцепровод самок других видов млекопитающих, например, крольчих. Недостаток метода – трудоемкость и возможные потери зигот при их переносе.

В настоящее время распространен метод краткосрочного хранения эмбрионов in vitro. При этом жизнеспособные эмбрионы переносят в питательные среды с температурой 37 ?С. В состав сред включены растворы солей, аминокислоты с бикарбонатным ионом как буферным агентом. Он обеспечивает рН в пределах 7,2 — 7,6. При этом биологические качества эмбрионов сохраняются до 95 часов.

Оценка эмбрионов. Производится несколькими методами: а) Морфологический метод – при этом основное внимание обращают на форму зиготы, равномерность дробления и т.д. б) Оценка по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы к различным красителям (например, синьке Эванса). в) Гистохимические методы – основаны на специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к различным красителям.

При оценке качества эмбрионов в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей: соответствие стадии развития эмбриона его возрасту; правильность формы прозрачной оболочки и ее целостность; состояние цитоплазмы и др.

Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины и т.д. Эмбрионы с замедленным развитием выбраковываются. Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, которые извлечены из матки коровы-донора на 7 — 8 сутки после первого осеменения.

Пересадка эмбрионов реципиентам. В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов; продуктивные, племенные и породные качества роли не играют. Основное условие хорошего приживления эмбрионов – синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов.

В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится следующими способами:

· Хирургический способ – эго эффективность 60 — 70 %, а число телят – 3 — 4 на донора. Этот способ использовали в основном до середины 70-х годов. Однако он требует больших затрат, его трудно применять в производственных условиях. Из-за возможных травм его нельзя многократного использовать.

· Нехирургический способ – прост, экономичен, возможно многократное использование реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Метод основан на введении эмбриона в рог матки через шейку. Аппликацию зародышей – 50 — 60 %.

Эффективность трансплантации повышается при пересадке двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки. Это позволяет получить двойные отелы. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен составляет 55 — 60 %, а при естественном многоплодии коров – всего 2 %. Также можно пересаживать эмбрион и оплодотворенной корове. При этом приживляемость эмбриона составляет 50 %.

Консервация эмбрионов. Самый эффективный метод – глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 ?С. Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет преимущества: а) пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов, поэтому нет необходимости в содержании больших групп реципиентов. В результате повышается рентабельность трансплантации; б) возможно создание эмбриобанков от генетически ценных животных. Это важно для сохранения генофонда редких и исчезающих пород, при транспортировке эмбрионов.

Выживаемость эмбрионов составляет 90 %, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится 50 — 55 %.

Эмбрионы замораживают в пробирках 50?6 мм или в ампулах вместимостью 1 мл. В них вносят 1 — 4 эмбриона от одного донора и 0,4 мл раствора криопротектора (например, 10 % раствор глицерина). Затем ампулы запаивают на пламени газовой горелки.

Возможно два режима охлаждения: 1) Ампулы или пробирки охлаждают с 20 до -6 ?С со скоростью 1 ?С в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0,3?С в минуту и погружают в жидкий азот. 2) Охлаждение от -7 до -35 ?С со скоростью 0,3 ?С в минуту; от -35 до -38 ?С со скоростью 0,1 ?С в минуту и погружение в жидкий азот.

Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 ?С в течение 10 — 12 секунд.

Дата добавления: 2016-02-27 ; просмотров: 692 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

helpiks.org

Заменит ли когда-либо выращивание зубов протезирование и имплантацию?

Ученые сегодня разрабатывают способы выращивания зубов у человека из стволовых клеток. Какими технологиями они располагают, и какова цена вопроса окажется для обычного пациента, попробуем описать ниже.

Потеря даже одного зуба в ряду становится ощутимой как на эмоциональном, так и на физиологическом уровне. Восстановить улыбку и жевательную функцию стараются за счет имплантации и протезирования. Но, вполне возможно, что совсем скоро медики предложат не искусственный заменитель, а естественные ткани, приживаемость которых будет в разы выше.

Исторические факты

В стоматологии уже давно задумались над тем, как сделать так, чтобы зуб вырастал в челюсти столько раз, сколько потребуется. Ведь природой заложено всего два таких периода – прорезывание молочных единиц и смена их на постоянные.

Первые научные разработки по выращиванию зубов у человека начались в 2002 году в Великобритании. Для эксперимента использовали шестимесячных поросят и крыс. Памела Йелик проводила следующие манипуляции:

  • Забирала недозревшие клетки дентальной ткани у животных и помещала в специальные ферменты.
  • Когда они становились сформированными, то их переносили на пластинку из полимера, которая разлагалась под воздействием развивающихся клеток.
  • Уже созданные, таким образом, полноценные зачатки вживлялись в мягкие ткани крыс.
  • Через три месяца можно было заметить появившиеся над десной коронки.
  • Уже на основе этих данных в Японии решили продвинуться дальше. В 2007 году провели эксперимент в Токийском университете науки под руководством Такаси Тсуджи. Здесь в качестве подопытных выступали мыши. И хоть получилось добиться полного формирования дентина, тем не менее над зубными корнями пришлось потрудиться дополнительно.

    Эксперимент продолжился через два года, когда японцы решили применить иную технологию. Для этого они использовали определенные клетки мышей, которые отвечают за рост и развитие зубов от природы. Помещали их в коллагеновую среду и стимулировали рост. После пересадки на место удаленной единицы ученые смогли добиться прорастания полноценного зуба. При этом создавалась не только нужная структура коронки и корня, но и нервно-сосудистый пучок пульпы.

    Ген, отвечающий за рост зубов

    Ученые обратили внимание на гены, которые регулируют количество единиц у взрослого человека, их появление, порядок, наличие зачатков, структуру и время прорезывания. Вплотную этим вопросом занялись медики в университете Цюриха.

    Так, выявлено, что за рост единиц на челюсти отвечает ген под названием Jagged2 и хромосома Notch. Они работают в паре, и когда первый перестает выполнять свою функцию, то второй выдает ошибки.

    Еще один ген Osr2 отвечает за формирование структуры и положения коронки зуба. И если каким-то образом его отключить, то они начинают появляться в неположенных и неожиданных местах, вырастают с явными деформациями, а то и вовсе делается волчья пасть.

    Ген под названием Msx1 полностью контролирует закладывание зачатков будущих зубов. Именно благодаря ему у нас сначала появляется 20 молочных единиц, а затем они в положенное время меняются на постоянные, и тогда вырастают еще 12. Правда, не у всех людей зачатки сформированы полностью и правильно.

    Интересно то, что если отключить вышеперечисленные гены, кроме последнего, то единичные зубы могут все равно прорезаться. А вот если нарушается работа Msx1, то даже зачатки не формируются вовсе. Поэтому ученые взяли на вооружение, что именно этот ген нужно использовать для самостоятельного выращивания зубов.

    Как продолжение изучения по восстановлению зубного ряда таким способом профессор Митсиадис пришел к выводу, что активность генов нужно использовать совместно со стволовыми клетками, взятыми из зачатков дентальных тканей. Именно их общая работа приведет к формированию полноценной единицы.

    Стволовые клетки способны регенерировать поврежденные ткани, заместить утраченные части собственным делением, поэтому такой способ может стать настоящим прорывом в мире по естественному восстановлению зубов.

    Продуманный метод в теории максимально прост:

  • изъятую стволовую клетку помещают в альвеолярную полость, из которой ранее выпал или удален зуб;
  • через некоторое время на этом месте формируется зачаток, схожий на тот, что появляется у эмбриона;
  • далее происходит процесс его роста, развития и прорезывания, что по ощущениям должно напоминать подобный период в детстве.
  • Очевидно, что такой способ выращивания зубов из стволовых клеток максимально напоминает естественное их появление. В результате единица образуется полностью сформированная, на своем месте и имеет все структурные элементы.

    Но здесь также есть ряд недостатков в практическом использовании метода:

    • С каждым годом у человека становится все меньше стволовых клеток, и если в 25 лет их еще может быть 1 на 100 тысяч, то в более зрелом возрасте обнаруживается только 1 на 500 000.
    • Само изъятие такой клетки оказывается затруднительным и очень болезненным процессом. Заданием для ученых пока является обнаружение более простого способа для забора материала.

    Проводимые эксперименты

    Самые удачные разработки по выращиванию зубов показали, что это сделать возможно, так как уже есть определенные достижения:

    • сформированная, таким образом, коронка полностью отвечает естественной структуре;
    • анатомическое строение выращенного зуба также соответствует природному и содержит все нужные элементы – нервно-сосудистый пучок, пульпу, дентин и эмаль;
    • твердость и прочность образованных тканей настолько высокая, что дает возможность выполнять все функциональные нагрузки челюсти.
    • Но недостатком пока остается размер выросшей единицы, который получается немного меньшей по объему. Тем не менее исследователи не останавливаются на достигнутом и придумывают новые технологии по максимально естественному восстановлению зубного ряда.

      Сами способы по выращиванию твердых тканей можно разделить на:

    • Внешние – при котором формируют единицу за пределами ротовой полости, например, в пробирке или особых клетках, гелях и пр. И только, когда зуб вырос, его пересаживают в пустующую лунку.
    • Внутренние – стволовые клетки, выделенные, например, из утраченных молочных зубов, вводят под слизистую. И уже в десне происходит развитие и рост целой единицы. Правда, этот метод считается не до конца проработанным и достаточно длительным.
    • Среди наружных способов особо выделяют два:

    • Когда процесс выращивания зуба происходит в органической культуре. Для этого берут мезенхимальные и эпителиальные клетки и помещают их в коллагеновый каркас. Именно здесь будет формироваться зачаток. Время роста зуба составляет около двух недель. Но при этом он полностью сформирован и имеет весь анатомический комплекс элементов.
    • С помощью специальной пробирки, в которую помещают те же клетки для формирования зубного зачатка. После определенного этапа его перекладывают уже в капсулу и внедряют в печень мыши.
    • Кроме генных технологий, некоторые ученые предлагают совершенно инновационные психо-социальные способы перепрограммирования. К ним относятся:

    • Метод Петрова – при этом пациент узнает о точном строении зуба, его корневой системе и структуре коронки. Затем он мысленно помещает стволовую клетку костного мозга в то место, где следует нарастить зуб и представляет весь процесс формирования зачатка и рост единицы.
    • Способ Веретенникова во многом схож с предыдущим, но здесь нужно учитывать не только строение зуба, но и правильность их прорезывания, очередность появления – от нижних резцов и до больших коренных, в строгой природной последовательности. Ученый предлагает мысленно представлять прорастание маленького зуба, как семени, создавая в нужном месте ощущения давления.
    • Технология Столбова – ученый, который на своем опыте показал, что воздействием мысли можно вырастить хоть 17 зубов подряд! Помимо создаваемой мыслеформы, параллельно с этим следует отказаться от вредных привычек, похудеть и научиться прислушиваться к своему организму.
    • Метод Шичко – предполагает использование самовнушения в период засыпания и правдивой информации. За счет письменных установок, которые пациент совершает перед сном в своем личном дневнике, можно заставить восстановить работу любого внутреннего органа, в том числе и утраченного зуба. Главное – планомерное воздействие на подсознание.
    • Среди новых разработок также выделяются еще две:

    • Использование ультразвука, когда с его помощью стимулируют десну и альвеолярный отросток к наращиванию твердой ткани. За счет такого своеобразного массажа можно заставить клетки функционировать в нужном направлении.
    • Лазерная коррекция – помимо безболезненных операций по заживлению различных органов, с его помощью можно стимулировать появление желаемых клеток и их рост. Таким образом, происходит полная регенерация тканей и восстановление утраченного зуба.
    • Какие побочные эффекты?

      Пока все лабораторные эксперименты не вошли в ежедневную практику стоматологов, так как имеют множество недоработок, побочных явлений, а иногда и непредвиденных результатов. Самыми важными деталями, над которыми еще следует потрудиться, являются такие сомнительные моменты:

      1. Сложно контролировать темпы роста единицы и ее элементов. Случается так, что дентин образуется намного быстрее, чем нервно-сосудистый пучок пульпы.
      2. Возможно появление патологических форм и строения самой коронки, что в дальнейшем обязательно повлияет на функциональность зуба и на здоровье ротовой полости в целом.
      3. Наш организм с развитой иммунной системой, скорее всего, будет реагировать на внедрение выращенного зуба или зачаток из стволовых клеток, как на инородное тело. Поэтому велики риски его отторжения. А чтобы снизить такой эффект человеку придется принимать препараты, значительно снижающие уровень иммунитета, что может привести к ослаблению здоровья на длительный период.

      Мнения критиков

      Не весь ученый мир придерживается таких оптимистических прогнозов по возможности выращивания полноценного зуба во рту пациента. Еще многие из них скептически относятся даже к успешным разработкам и результативным экспериментам. Они утверждают, что если в некоторых условиях удалось нарастить у мыши какие-то отдельные единицы, то это не значит, что то же самое получится и с человеком.

      Никто не сможет предугадать, как поведут себя стволовые клетки в десне, образуют ли они нужный зуб в желаемом месте, да еще и правильной формы. Невозможно предвидеть, как будет реагировать организм отдельно взятого человека на вживление таких клеток или целой выращенной единицы. Даже эксперименты с пересадкой зубов с одной челюсти на другую у человека не принесли желаемого результата, показав очень низкий процент приживаемости.

      Самым же сомнительным вопросом остается – как повлиять на структуру и форму зуба, который требуется вырастить? Ведь стволовые клетки не знают, нужен нам резец, моляр или клык. Что вырастет и правильно ли это произойдет?

      Видео: ученые начали выращивать зубы в пробирке.

      Когда будет доступна процедура?

      Те ученые, которые пока воодушевлены результатами экспериментов, обещают скорое решение проблемы. Так, японские разработчики считают, что продвинулись уже достаточно далеко в своих технологиях, и осталось только дифференцировать создаваемые зачатки, чтобы точно рассчитывать в каком альвеолярном отростке вырастет подходящая единица.

      Они обещают, что уже к 2030 году смогут предоставить полноценные и эффективные результаты по выращиванию зубов из стволовых клеток и распространить свой метод в массы. Именно их разработки должны полностью вытеснить современное протезирование и имплантацию.

      Цена процедуры

      Предугадать стоимость такого способа восстановления улыбки достаточно сложно, так как его пока нигде не проводят. Но медики приблизительно рассчитывают на окончательную сумму исходя из отдельных процедур, необходимых для этого.

      Так, стоимость извлечения стволовых клеток находится в районе 1000 евро. Если же к этому добавить необходимые инъекции, дополнительные материалы и прочие проводимые процедуры, то можно оценить весь процесс выращивания зуба у человека в 3000 евро, что значительно дороже имплантации.

      При появлении такого способа восстановления зубного ряда, воспользоваться им смогут только те, кто финансово обеспечен. Большей части населения она окажется недоступной. Пока в некоторых клиниках предлагаются экспериментальные процедуры по выращиванию единиц, но пациент должен не только заплатить 3000 евро за нее, но и подписать согласие на то, что готов к неожиданным результатам.

      infozuby.ru

    Рубрики: Выращивание